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Jul 29, 2023

La fixation du méthanol est la méthode de choix pour les gouttelettes

Communications Biology volume 6, Numéro d'article : 522 (2023) Citer cet article 2289 Accès 1 Citations 24 Détails d'Altmetric Metrics Une correction de l'éditeur à cet article a été publiée le 13 juin

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 522 (2023) Citer cet article

2289 Accès

1 Citation

24 Altmétrique

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Une correction de l'éditeur à cet article a été publiée le 13 juin 2023.

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La principale étape critique de la transcriptomique unicellulaire est la préparation des échantillons. Plusieurs méthodes ont été développées pour préserver les cellules après dissociation afin de dissocier la manipulation des échantillons de la préparation de la bibliothèque. Cependant, l’adéquation de ces méthodes dépend des types de cellules à traiter. Dans ce projet, nous effectuons une comparaison systématique des méthodes de conservation pour le séquençage d'ARN unicellulaire basé sur des gouttelettes sur des cellules neurales et gliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Nos résultats montrent que si le DMSO offre la plus haute qualité cellulaire en termes de molécules d'ARN et de gènes détectés par cellule, il affecte fortement la composition cellulaire et induit l'expression de gènes de stress et d'apoptose. En revanche, les échantillons fixés au méthanol présentent une composition cellulaire similaire aux échantillons frais et fournissent une bonne qualité cellulaire et peu de biais d’expression. Pris ensemble, nos résultats montrent que la fixation du méthanol est la méthode de choix pour réaliser des expériences de transcriptomique unicellulaire basées sur des gouttelettes sur des populations de cellules neurales.

Les méthodes de transcriptomique unicellulaire (scRNA-seq) ont révolutionné la façon dont nous étudions à haut débit l'expression de gènes chez les individus, les tissus et même dans les maladies1,2,3. Auparavant, les études se limitaient à identifier les changements dans les niveaux d’expression des gènes en masse, c’est-à-dire dans la population de cellules composant un échantillon particulier. Ainsi, ces approches mélangeaient deux effets différents : des changements dans la composition cellulaire de l’échantillon d’intérêt et des changements dans l’expression de gènes au sein de cellules individuelles. Désormais, scRNA-seq permet d’évaluer ces deux effets indépendamment et peut détecter à la fois les changements dans la composition cellulaire4,5 et l’expression de gènes dans des types de cellules spécifiques6,7.

Malgré la popularité des méthodes scRNA-seq, plusieurs défis techniques restent encore à résoudre. Par exemple, la dissociation des cellules d'un tissu et l'obtention d'une bonne suspension cellulaire, nécessaire au séquençage du scRNA, sont hautement spécifiques au tissu et peuvent nécessiter l'utilisation de différentes stratégies, notamment la digestion enzymatique, la désgrégation mécanique, l'activation de la fluorescence cellulaire. tri et autres technologies8,9,10,11,12. En conséquence, la préparation des échantillons pour scRNA-seq peut prendre plusieurs heures, ce qui rend plus pratique leur traitement ultérieur. Outre les difficultés techniques, la préservation des cellules est également importante si nous devons dissocier la dissociation et le traitement des échantillons pour d'autres raisons, telles que l'expédition d'échantillons vers une installation externe, ou si nous souhaitons collecter plusieurs échantillons et les traiter ensemble ultérieurement. pour gagner du temps ou de l'argent. Dans tous ces cas, les chercheurs souhaitent conserver ces échantillons de manière à minimiser les différences de composition cellulaire et d’expression génétique des cellules individuelles par rapport à l’échantillon d’origine. Autrement dit, la meilleure méthode de conservation sera celle qui aura le moins d’impact sur la composition cellulaire de l’échantillon et sur le profil transcriptomique des cellules individuelles.

Plusieurs méthodes de préservation cellulaire ont déjà été développées pour surmonter ce problème et dissocier la manipulation des échantillons de la préparation de la bibliothèque. Parmi eux, nous trouvons des solutions artisanales et commerciales, notamment la fixation du méthanol13,14, le propionate de dithio-bis succinimidyle15, la cryoconservation du diméthylsulfoxyde (DMSO)16,17, le méthanol acétique (ACME)10, le paraformaldéhyde18, CellCover17 et vivoPHIX19. Ces méthodes visent à maintenir la composition des échantillons et la qualité de l’ARN des cellules. Cependant, étant donné que la préparation des échantillons est spécifique aux tissus, nous pensons que différentes méthodes de conservation pourraient être optimales pour différents échantillons. Beaucoup de ces protocoles ont été testés uniquement sur des lignées cellulaires ou sur des cellules faciles à obtenir telles que les cellules du sang périphérique. On ne sait donc pas clairement quelles sont leurs performances dans des cellules difficiles à dissocier ou potentiellement endommagées lors de la dissociation. En particulier, aucune des méthodes précédentes n’a été testée sur des neurones matures ou sur des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC), qui constituent la principale source de cellules neurales pour l’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des maladies neurologiques20.