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Aug 09, 2023

Défis et solutions dans la conception des tests PCR

Crédit : Sebastian Condrea/Getty Images La conception de tests PCR reproductibles implique l'optimisation de plusieurs cibles mobiles, depuis la standardisation de chaque composant dans des volumes de réaction parfois infimes jusqu'à

Crédit : Sébastien Condrea / Getty Images

La conception de tests PCR reproductibles implique l'optimisation de plusieurs cibles mobiles, depuis la standardisation de chaque composant dans des volumes de réaction parfois infimes jusqu'à la planification à l'avance pour garantir un stockage sécurisé et à long terme des réactifs, des échantillons et des produits PCR.

Comprendre les subtilités et les défis communs impliqués dans le développement et l’optimisation des tests de diagnostic basés sur la PCR aidera les chercheurs à surmonter ces obstacles en utilisant les dernières solutions disponibles. Nous discutons ici de certains des défis courants que les chercheurs peuvent rencontrer lors de la conception d'un test de diagnostic moléculaire basé sur la PCR, ainsi que de certaines solutions potentielles.

L’un des premiers défis rencontrés lors de la conception d’une réaction PCR consiste à choisir la polymérase optimale pour l’application. Il est essentiel de peser vos besoins en fonction des caractéristiques de l’échantillon biologique, de la longueur de la séquence à amplifier et de la précision souhaitée de la séquence du produit amplifié.

Gerald Hunter, PhD, chercheur en applications sur le terrain chez Fortis Life Sciences, qui possède une vaste expérience dans l'optimisation des tests PCR, déclare : « Différentes ADN polymérases ont des spécificités, des fonctions enzymatiques, des taux d'erreur (fidélités) et une tolérance aux inhibiteurs de la PCR différents. »

La conception d’amorces qui s’hybrident avec des matrices d’ADN à une température prévue avec une spécificité élevée et l’optimisation de la composition du mélange réactionnel posent les prochains défis.

"Le succès de la PCR repose sur la capacité de votre réaction à maintenir un faible taux de liaison d'amorce non spécifique et, par conséquent, la température d'hybridation devient un facteur critique qui doit être optimisé", explique Hunter. "De plus, les composants du tampon PCR (pH, sel, Mg2+, amorce et concentration en enzyme, qui jouent tous un rôle dans les performances de la réaction) doivent être pris en compte et peuvent nécessiter une optimisation."

L'amplification non spécifique se produit généralement lorsque les amorces se lient à des séquences pour lesquelles elles ne sont pas conçues. Cela entraîne des produits inattendus.

«Le design d'amorce est à la fois un art et une science. Non seulement la bonne concentration d’amorces est importante, mais il est également important d’avoir la bonne séquence d’amorces », explique Hunter. "Heureusement, il existe de nombreux outils logiciels gratuits de conception d'amorces en ligne qui peuvent être utilisés pour la conception d'amorces PCR, mais ne soyez pas surpris si vous devez tester une poignée de paires d'amorces avant de trouver la bonne combinaison."

Une façon d'éviter l'amplification non spécifique consiste à préparer votre mélange réactionnel sur de la glace jusqu'à ce que vous soyez prêt à insérer votre tube ou bandelette PCR dans le thermocycleur. La basse température réduit l’activité de l’ADN polymérase, diminuant ainsi la probabilité que les amorces se lient de manière imprécise. Malgré cette précaution, des produits indésirables peuvent encore être synthétisés.

Une solution supplémentaire pour contrer l’amplification non spécifique consiste à utiliser une ADN polymérase à démarrage à chaud. L'ADN polymérase à démarrage à chaud est chimiquement modifiée pour être inactive à température ambiante et empêcher une amplification non spécifique. Les nucléotides ne sont enchaînés par l’enzyme modifiée qu’une fois qu’une étape d’activation thermique a eu lieu. Cela permet le montage de la réaction PCR à température ambiante, sans possibilité de produits parasites et de formation de dimères d'amorce. Un avantage supplémentaire de la PCR à démarrage à chaud est que les conditions du cycle de réaction sans activation thermique peuvent être utilisées comme contrôle négatif.

Le multiplexage est la capacité de détecter une gamme de conditions ou de facteurs dans un seul test, plutôt que d'effectuer des tests individuels pour chaque paramètre.1 Il améliore le débit, réduit les coûts des tests et améliore l'efficacité des soins aux patients.

Le multiplexage est souvent remis en question par la conception des amorces. Les amorces pour les PCR multiplex doivent être hautement sélectives pour le séquençage de cibles avec des températures de fusion constantes qui produisent des amplicons de longueur uniforme. Cela nécessite un calcul minutieux lors de la conception des amorces. Si elles sont mal conçues, les amorces forment des homo- ou hétéro-dimères, ou amplifient des séquences hors cible.